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反相色譜（Reverse Phase Chromatography，RP-HPLC）中常用的流動相添加劑主要有以下幾大類，具體作用和應用舉例如下：
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## 一、緩沖鹽/緩沖液（Buffer）
### 1. **常見種類**
- **磷酸鹽緩沖液**（如磷酸二氫鈉、磷酸氫二鉀等，pH 2.0~8.0 范圍常用）
- **醋酸鹽緩沖液**（如醋酸鈉/乙酸，pH 3.0~6.0）
- **甲酸鹽緩沖液**（如甲酸鈉）
- **三乙胺緩沖液**或類似胺類
### 2. **作用**
- 控制流動相pH，穩定分析組分的離解狀態，提高方法重現性。
- 適當緩沖鹽可以提高峰形或調節保留時間。
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## 二、離子對試劑（Ion Pair Reagents）
### 1. **陽離子分析常用**
- **三氟乙酸（TFA）**
- **正辛烷磺酸鈉（SDS）**
- **磷酸二辛酯（DOPA）**
### 2. **陰離子分析常用**
- **四丁基溴化銨（TBAB/ TBAH）**
- **四乙基溴化銨、四甲基溴化銨等**
### 3. **作用**
- 通過形成疏水性離子對，提高強極性/帶電分析物在反相填料上的保留，實現難保留或難分離物質的有效拆分。
- 改善峰形。
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## 三、調節劑/抑制劑
### 1. **常見調節劑**
- **三乙胺（TEA）/ 二乙胺等有機胺**
（常用于抑制堿性化合物與柱上硅醇基殘基交互作用，改善峰形。）
### 2. **常用酸**
- **甲酸、乙酸**（常見于LC-MS聯用，減少離子抑制）
- **TFA（三氟乙酸）**（強揮發性酸，適用肽、蛋白類分析）
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## 四、金屬離子/絡合物/螯合劑
### 1. **金屬離子**
- **銅(II)離子（Cu2+）**（用于氨基酸手性分離等）
### 2. **螯合劑**
- **EDTA**
（用于螯合流動相中的金屬離子，防止色譜柱活性點金屬污染，減小拖尾）
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## 五、有機修飾劑（添加量極低）
如
- **乙腈、甲醇**（本身為反相流動相主成分，但微量添加亦有調節保留的作用，通常被歸類為主溶劑）
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## 六、防止微生物/抗菌劑
如0.02%疊氮化鈉 NaN?（防止緩沖體系變質，對HPLC柱有腐蝕性，僅供特殊考量）
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## 七、特殊添加劑
- **Brij-35、Tween-80等表面活性劑**（某些加合物分析或蛋白質分析）
- **尿素**等穩定劑（蛋白去折疊）
- **β-環糊精**（手性分離添加劑，增強特異保留）
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## 八、國際常用組合舉例
| 用途 | 添加劑示例 | 典型濃度 | 備注 |
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| LC-MS | 0.1% 甲酸 或 0.1% TFA | 0.01–0.1%（v/v） | 甲酸適合MS，TFA易抑制響應 |
| 通用蛋白/肽 | 0.1% TFA | 0.05~0.2% | 改善峰形 |
| 高分子/糖類 | 20 mM 磷酸鹽緩沖液 | 10~50 mM | pH調至5~7 |
| 離子對法 | TBAB（2 mM） | 1~10 mM | 分離陰離子物質 |
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## 總結表
| 類別 | 常見添加劑 | 主要作用 |
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| 緩沖鹽 | 磷酸鹽、醋酸鹽 | 穩定pH，改善重現性 |
| 強酸/弱酸 | 甲酸、TFA、乙酸 | 阻止硅醇基作用、改善峰形 |
| 有機胺 | TEA、DEA | 屏蔽硅醇基、改善堿性組分峰形 |
| 離子對試劑 | TBAB, TBAHS, OS, TFA | 分離帶電強極性物質 |
| 金屬離子 | Cu2?、Zn2? | 專用分離（如氨基酸、肽類） |
| 螯合劑 | EDTA | 緩解金屬離子的負面影響 |
| 微生物防腐 | NaN? | 防止緩沖液發霉、細菌污染 |
| 特殊功能劑 | Brij-35、β-環糊精 | 特定體系或手性分離 |
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**結論**
反相色譜流動相添加劑通過調節pH、離子強度、減少拖尾、改善峰形、提高分離度、抑制非特異性吸附等，在復雜組分分析中發揮著極其重要的作用。選擇時需兼顧目標化合物性質、質譜兼容性及檢測靈敏度等因素。
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