做液相色譜的同學(xué)都知道，液相色譜分離條件中，最重要的參數(shù)就是洗脫條件，其中分離條件又分為等度洗脫和梯度洗脫。

等度洗脫

是指在樣品組分的分析周期中，流動(dòng)相的組成比例和流速恒定不變的洗脫方式。

梯度洗脫

是指在同一個(gè)分析周期中，按一定程度不斷改變流動(dòng)相的濃度配比的洗脫方式。

在色譜分析時(shí)，等度洗脫和梯度洗脫各有優(yōu)勢(shì)和劣勢(shì)。

優(yōu)點(diǎn)

?對(duì)于等度洗脫而言，由于方法運(yùn)行時(shí)，流動(dòng)相的比例不發(fā)生變化，所以它對(duì)儀器的要求不高，只需要一個(gè)單元泵就可以運(yùn)行方法。

?其次，由于等度洗脫條件單一，所以比較容易用來(lái)摸索方法設(shè)置，例如改變流動(dòng)相比例，改變柱溫等條件。

?并且由于等度洗脫每次運(yùn)行時(shí)的流動(dòng)相比例相同，所以相同方法運(yùn)行多個(gè)樣品時(shí)，樣品之間不需要設(shè)置平衡時(shí)間來(lái)讓系統(tǒng)恢復(fù)到所需的流動(dòng)相比例。

缺點(diǎn)

?但是它也有缺點(diǎn)，那就是越往后出峰的組分色譜峰越寬。

?并且大多數(shù)等度洗脫的方法分析時(shí)間較長(zhǎng)。

等度洗脫

優(yōu)點(diǎn)

?而梯度洗脫能夠規(guī)避掉等度洗脫的問(wèn)題，例如梯度洗脫的樣品峰，無(wú)論先出峰還是后出峰的組分，它們的峰形基本都能保證尖銳對(duì)稱。

?其次由于梯度洗脫通常設(shè)置的流動(dòng)相比例是讓洗脫強(qiáng)度越來(lái)越強(qiáng)，這樣能保證在較短的時(shí)間內(nèi)，讓樣品中強(qiáng)保留組分也能被洗脫出來(lái)。

缺點(diǎn)

?但是伴隨著這些優(yōu)點(diǎn)也會(huì)有對(duì)應(yīng)的缺點(diǎn)，首先它對(duì)儀器的配置要求較高，通常需要配置四元泵或者二元泵。

?其次它在每次運(yùn)行樣品之間，需要設(shè)置一定的平衡時(shí)間，來(lái)讓系統(tǒng)中流動(dòng)相的比例到達(dá)初始流動(dòng)相比例。

?最后，由于它的方法設(shè)置復(fù)雜，例如影響分離的有初始流動(dòng)相比例、流動(dòng)相的梯度變化、結(jié)束流動(dòng)相比例、柱溫箱溫度等，所以方法的開發(fā)和優(yōu)化會(huì)較為復(fù)雜。

梯度洗脫

了解了這么多等度洗脫和梯度洗脫的優(yōu)缺點(diǎn)，很多同學(xué)可能會(huì)有疑問(wèn)，我如何知道我的樣品適合等度洗脫還是梯度洗脫呢？

不用著急，這是有規(guī)律可循的。

對(duì)于常規(guī)樣品而言，建議大家在初始設(shè)置方法時(shí)可以先參考以下初始條件運(yùn)行：

20分鐘內(nèi)，將有機(jī)相比例從5-10%線性升高至100%，并保持一段時(shí)間以保證所有組分被洗脫出來(lái)。

如果在梯度結(jié)束后，有組分的洗脫時(shí)間超過(guò)梯度時(shí)間的25%，也就是該條件中如果有化合物在25分鐘之后被洗脫出來(lái)，則需要考慮更換保留能力更弱的色譜柱或更換極性更強(qiáng)的有機(jī)溶劑。

我們可以看出 ΔtG>0.25 tG，所以該方法不適合等度洗脫。
適合等度洗脫的方法要求 ΔtG<0.25tG。

 

如果你的方法適合等度洗脫，那么又該如何設(shè)置呢？

tr(avg)=(ti+tf)/2=17min

Δ%B/min=(%Bfinal-%Binitial)/tG=(100-5)/20=4.75 %B/min

等度洗脫流動(dòng)相比例=(Δ%B/min x tr(avg))+%Binitial=(4.75x17)+ 5=85.75≈86%B

綜上所述，如果該樣品可以用等度洗脫，那么方法設(shè)置為：水相與有機(jī)相比例為14：86，保持17min。

 

梯度洗脫如何設(shè)置

如果該樣品需要做梯度洗脫，方法參數(shù)又該如何設(shè)置呢？

梯度洗脫主要包括以下幾個(gè)參數(shù)：初始流動(dòng)相比例、結(jié)束流動(dòng)相比例和流動(dòng)相變化速率，同樣以之前的樣品為例：

Δ%B/min=(%Bfinal-%Binitial)/tG=(100-5)/20=4.75 %B/min

調(diào)整后的初始流動(dòng)相比例

Optimized%Binitial

=(%Binitial+(tixΔ%B/min))-(V/FxΔ%B/min)-10%B

=(5+(12.786x4.75))-(5.5/2x4.75)-10

=42.67%B

調(diào)整后的結(jié)束流動(dòng)相比例

Optimized%Bfinal

=(%Binitial+(tfxΔ%B/min))-(V/FxΔ%B/min)-10%B

=(5+(21.142x4.75))-(5.5/2x4.75)-10

=82.36%B

通過(guò)計(jì)算得到調(diào)整后的初始流動(dòng)相比例等于42.67%，調(diào)整后的結(jié)束流動(dòng)相比例等于82.36%。