樣品稀釋劑在HILIC中的重要性

引言

當(dāng)使用親水相互作用液相色譜法（HILIC）時(shí)，樣品稀釋劑的選擇對(duì)峰形有顯著的影響。稀釋劑的錯(cuò)誤選擇可能會(huì)導(dǎo)致色譜峰形差，峰分裂和保留時(shí)間的不穩(wěn)定。

這張ACE知識(shí)卡片探討了在HILIC方法開發(fā)過程中如何確定合適的稀釋劑。

樣品稀釋劑與峰形

理想情況下，HILIC模式下樣品的稀釋劑應(yīng)該盡可能的接近分離化合物的流動(dòng)相組成，即稀釋劑由高比例的弱溶劑組成，如乙腈。對(duì)HILIC模式下梯度洗脫，樣品稀釋劑應(yīng)該類似梯度方法流動(dòng)相的起始條件。在某些情況下，可能會(huì)出現(xiàn)這種情況，極性化合物的樣品溶解度問題：在HILIC中可能會(huì)遇到分析物相對(duì)不溶于高濃度的有機(jī)溶劑。

有時(shí)候，遇到HILIC峰形問題可以通過樣品稀釋劑的選擇來解決。樣品溶解在含高水稀釋劑中是否為問題源頭，因?yàn)樗菑?qiáng)溶劑，洗脫能力強(qiáng)。樣品被大量水包圍，破壞了化合物分配到HILIC固定相表面富水層的機(jī)制。這就導(dǎo)致了化合物較差的峰形和保留時(shí)間的不穩(wěn)定，尤其是保留較弱的化合物。圖1 顯示了2-脫氧尿苷分別用流動(dòng)相和水做稀釋劑獲得的峰形圖。當(dāng)被分析物溶解在水里，觀察到峰寬很大，幾乎裂開的峰。通過用流動(dòng)相來改變樣品的稀釋液，峰的形狀和信號(hào)強(qiáng)度得到顯著的改善。

HILIC色譜法，樣品的稀釋劑選擇視具體應(yīng)用而定，因此在方法開發(fā)中，應(yīng)分配資源研究樣品稀釋劑的影響，通常是稀釋劑的作用強(qiáng)度影響可能依賴于分析物，還受固定相和洗脫液的條件的影響。因此建議進(jìn)行分步調(diào)查來探究提高有機(jī)溶劑的比例對(duì)于峰形和方法的影響。在50 - 90%乙腈中以增加10%的乙腈量增加：緩沖液可以幫助理解如何實(shí)現(xiàn)目標(biāo)分析物的最佳峰形。

圖1.樣品稀釋劑對(duì)于2-脫氧尿苷峰形的影響

色譜柱：ACE 5 HILIC-N, 150 x4.6mm.流速：1.5mL/min。流動(dòng)相：10 mM 甲酸銨 pH4.7 in乙腈：水=9：1。進(jìn)樣量：5uL.。溫度：25℃。 檢測器：UV，254nm。

圖2顯示了在流動(dòng)相pH 3.0 條件下，堿性、酸性和中性分析物的樣品稀釋劑對(duì)于三個(gè)ACE HILIC固定相（ACE HILIC-A、ACE HILIC-B、ACE HILIC-N）的影響的研究結(jié)果。樣品稀釋劑為乙腈和水的混合溶液，水的百分率介于0-100%之間。

次黃嘌呤（極性中性）的峰形一般隨著乙腈濃度的增加而改善，最佳的有機(jī)溶劑含量在60-80%左右。酪胺(堿性)在低百分比有機(jī)相稀釋劑條件下，HILIC-B和HILIC-N上出現(xiàn)分裂峰， HILIC-A峰形很差。當(dāng)乙腈的濃度大于60%，峰形得到顯著的改善。扁桃酸的峰形在HILIC-B和HILIC-N相上受稀釋劑的影響較小，而對(duì)于HILIC-A相，在高水濃度下峰形較差。總的來說，從這個(gè)數(shù)據(jù)集合來看，對(duì)于這個(gè)應(yīng)用，樣品推薦使用由60-80%有機(jī)相組成的稀釋劑。

圖2：次黃嘌呤、酪胺和扁桃酸在（a）ACE 5 HILIC-N、（b）ACE 5 HILIC-A、（c）ACE 5 HILIC-B，150 x 4.6mm。在乙腈：水（90：10 v/v）甲酸銨調(diào)溶液pH 3.0。流速：1.5mL/min。溫度：25℃。檢測器：UV，254nm。進(jìn)樣量：5uL。

結(jié)論：

樣品稀釋劑的選擇對(duì)峰形和方法有重要影響。一般來說，就是樣本稀釋劑應(yīng)由盡可能高比例的較弱的流動(dòng)相溶劑(HILIC模式中通常是乙腈)組成。應(yīng)盡可能避免使用含高比例水的樣品稀釋劑。對(duì)于一個(gè)給定的應(yīng)用，一個(gè)系統(tǒng)的樣品稀釋劑評(píng)估，可以幫助消除任何不良峰形的影響。